Expertise

Modèles Animaux Uniques

  • Souris mdx (homologue à la Dystrophie Musculaire de Duchenne humaine)
  • Souris mdx avec une invalidation génétique des récepteurs Toll-like (TLR4, TLR2) et des récepteurs aux chimiokines (CCR2, CCR1)
  • Modèle de lésion aigu du diaphragme
  • Modèles d’exposition intermittente ou continue à l’hypoxie
  • Modèles de dysfonctions diaphragmatiques induites par la ventilation

Figure: (A) Diaphragme de souris mdx avec une phase inflammatoire précoce (des macrophages positifs pour F4/80 sont montrés), suivis par (B) phase fibrotique sévère (coloration au Sirius red du collagène). (C) Modèle de lésion aigu du diaphragme induit par la cardiotoxine montrant une absorption du colorant Procion dans les fibres musculaires ayant des dommages à la membrane, suivis par (D) Régénération intense du diaphragme (coloration à la chaine lourde de myosine embryonaire). (E) Les souris mdx sont injectées avec des cellules stromales mésenchymateuses (CSMs) modifiées par rétrovirus pour créer un “organoide” qui libère de manière continue dans la circulation sanguine une molécule inhibant CCR2.

Cultures Primaires de Cellules

Les cultures primaires de cellules myogéniques sont dérivées de cellules satellites obtenues de myofibres isolées, assurant ainsi une pureté maximale. Les cultures de macrophages dérivés de la moelle osseuse sont aussi générées à partir de nos différents modèles expérimentaux afin de mieux comprendre les interactions entre les cellules myogéniques et hématopoiétiques.

Figure: (A) Immunofluorescence de HMGB1 (vert) et LAMP1 (rouge) dans des cultures différenciées de myotubes.
(B) Macrophages dérivés de la moelle osseuse traités avec de l’Interféron-gamma ou (C) de l’Interleukine-4.

Transfert de Gène In Vivo

Différents systèmes de vecteurs (viraux et non-viraux) sont utilisés pour réaliser un transfert de gène in vivo au diaphragme et aux autres muscles.

Figure: (A) Expression d’une protéine verte fluorescente (GFP) dans le diaphragme 5 jours après une transfection de gène in vivo via l’électroporation d’un plasmide. (B) Expression de la GFP dans une fibre isolée après transfection in vivo d’un plasmide d’expression d’une GFP standard (panneau du haut) ou avec un plasmide codant pour une GFP associée à une séquence de localisation nucléaire (panneau du bas).

Laser de Capture et de Microdissection

Le Laser de Capture et de Microdissection (LCM) permet d’isoler de manière ultra précise certains composants cellulaires des sections de tissu tout en conservant son intégrité biologique.

Figure: (A) La fibre musculaire à noyau central a été (B) enlevée de la section de tissu à l’aide du LCM, puis analysée par la suite en PCR quantitative (voir ci-dessous).

Droplet Digital™ PCR (DDPCR™)

Le Droplet Digital™ PCR permet de quantifier l’expression des gènes dans des échantillons très petits avec une precision et une fiabilité sans précédent. Cette propriété du DDPCR™ en fait un atout de choix qui complémente à la perfection l’utilisation du Laser de Capture et de Microdissection.

Figure (ci-dessus): Représentation schématique de la technologie de DDPCR™.

Cytométrie en Flux

La cytométrie en flux est employée pour caractériser le phénotype des cellules présentes dans le muscle squelettique et le sang in vivo, ainsi que les cellules cultivées in vitro, dans différentes situations pathophysiologique comme la dystrophie musculaire, la régénération musculaire aigue, et l’hypoxie.

Figure: (A) Stratégie d’analyse utilisée pour l’isolation des macrophages intramusculaires (CD45+ CD11b+ F4/80+ cells). (B) Pourcentage de ces cellules exprimant les marqueurs macrophagiques classiques M1 (iNOS) et M2 (CD206) déterminés chez des souris dystrophiques standard (mdx) versus des souris dystrophiques invalidées pour le récepteur Toll-like 4 (mdx-TLR4-/-).

Analyse d’Expression de Gènes

Figure: Cartographie d’expression génique dessinée en utilisant une analyse par classification ascendante hiérarchique des gènes différentiellement exprimés dans le diaphragme de sujets contrôles (Control Dia) et de patients qui ont subi une ventilation mécanique prolongée (MV Dia) à l’unité des soins intensifs.

Microscopie Confocale

Figure: (A) Imagerie par microscopie confocale du diaphragme coloré avec de l’oil red-O de sujets contrôle (control) et de patients qui ont subi une ventilation mécanique prolongée à l’unité des soins intensifs (MV), afin d’évaluer le contenu lipidique intramyocellulaire. (B) La reconstruction tridimensionnelle des images confocales est utilisée pour quantifier la densité et le volume des gouttes lipidiques intramyocellulaires.

Histologie Quantitative du Muscle

Plusieurs méthodes de mesures telles que le comptage par points, la ségrégation par seuil de couleur et l’analyse par densité intégrée sont couplées avec des échantillonnages systématiques et non biaisés afin de fournir des données quantitatives fiables.

Figure: Quantification par comptage par point de la nécrose dans un diaphragme dystrophique. La grille est superposée de manière aléatoire sur l’image du tissu et les structures d’intérêt (c’est-à-dire les fibres nécrosées) qui sont coupées par la grille sont mises en évidence (points verts).

Physiologie du Muscle

Chez la souris, une stimulation électrique est appliquée à une portion de muscle isolée dans un bain de préparation organique ou in situ au muscle entier à différentes fréquences, et la force générée est directement déterminée. Chez l’humain, une stimulation magnétique indolore est appliquée sur les nerfs phréniques et les pressions respiratoires générées sont utilisées pour évaluer la force des muscles respiratoires.

Figure: (A) Bain organique in vitro utilisé pour determiner la force que le diaphragme est capable de générer. (B) Comparaison de la force générée par le diaphragme chez les souris contrôles (WT) et mdx. (C) Stimulation magnétique bilatérale des nerfs phréniques pour analyser la force générée par le diaphragme chez l’humain.